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细胞转染—PEI 配置方法及转染流程
发布时间:2022/03/21

注:我司为Polysciences官方授权独家代理商(申明日期:2024年1月1日)


一、产品介绍

Polysciences公司提供一系列PEI产品:研究级产品PEI MAX和Transporter 5,以及cGMP级MAXgene GMP,提供适合于任何规模AAV、LV病毒载体和重组蛋白制造的成本效益更高、供应可靠且更高质量的转染试剂。


PEI MAX 是一款高浓缩的粉剂,多数科学家选择PEI MAX ,在内部自行制备更低成本、效益更高的转染试剂。多年以来,经过众多业内人士评审的公开研究和出版文献表明,在HEK293、CHO 和 Sf9系统中可获得更高的转染效率,在重组抗体和病毒载体生产中稳定性更高,可靠性更强。PEI MAX是一种非GMP等级转染试剂,适用于基础科学研究及药物研发早期阶段。


PEI MAX 40K 是线性Polyethylenimine,PEI盐酸盐形式,是线性Polyethylenimine PEI 25K的升级产品。相比于PEI25K,PEI MAX 40K :

 

· 水解形式(去乙酰化);

· 盐酸盐形式,具更高的水溶特性;

· 含更长连续性片段,其质子化氮水平比PEI 25K提高11%以上。


Transporter 5转染试剂是一种专利的即用型线性PEI衍生物。由PEI MAX配置而成的即用型无菌试剂,采用0.1μm PES无菌过滤器,可消除支原体污染风险。适用于工艺开发、临床前和早期临床研究,助力过渡到MAXgene用于cGMP生产。


MAXgene GMP (cat# 26406/26435) 是一种cGMP转染试剂,在Polysciences研究等级转染试剂(PEI MAX 或 Transporter 5)的效率和可扩展性基础上增加了验证工艺和监管流流程,适用于细胞和基因治疗病毒载体的研发和生产。


二、产品特点

Polysciences PEI转染试剂优势:


· 更高质量的R&D和cGMP等级产品;

· 更高转染效率,更低细胞毒性;

· MAXgene符合cGMP标准和ISO13485质量管理体系;

· 经过验证的生产工艺;

· 以“全合成”形式,无动物源成分;

· 更高性价比,适用于从早期研发到临床及商业化生产的各个阶段;

· 严格控制批间稳定性;

· 国内外已有多个项目进入临床阶段;

· 具备残留检测方法。


三、使用方法

PEI MAX粉末配置方法:


1) 将1g PEI MAX 40K放入盛有900 mL水的玻璃烧杯中

2) 放入搅拌转子,放置于磁力搅拌器上,设置搅拌程序以形成一个较小的漩涡

3) 等待PEI MAX 40K溶解,通常需要5分钟左右

4) 用25 mL塑料移液管加入1 N NaOH溶液滴定至pH 6.9~7.1

5) 如果不小心超过7.1,则使用1N的盐酸和新的塑料移液管将pH重新滴定至6.9~7.1

6) 将溶液转移到1L玻璃量筒中,加入水定容至1L

7) 用无菌真空过滤膜过滤配制的转染试剂溶液

8) 按需分装,4°C储存

注:未经配制的粉末有效期为2年。


配置成液体后分装在合适的瓶子中,并且保存在4℃的转染试剂将可在6个月之内保持性能,如仅用于蛋白定性研究,分装的转染试剂可延长有效使用期至1年。


四、经过驯化的无血清培养悬浮细胞转染流程


1. 准备工作

转染前2~3小时,种植细胞密度为 1X106/mL 于培养容器中。 


2. 转染步骤

(以250 mL摇瓶为例,转染前种植细胞总体积为25mL,最终总培养体积为50mL) ,准备PEI-DNA 转染混合物(按照以下操作顺序):

 

1) 在含有2.5mL(25mL 的 10%)稀释液的 EP 管中加入50ug质粒DNA(质粒用量建议在 1~2ug/106细胞之间优化,此处使用1ug/106细胞)

2) 轻轻地混匀/振荡溶液 

3) 在DNA溶液中加入50~200uL PEI转染试剂(PEI/DNA 的比例建议在1~4:1之间优化,初次推荐使用2:1或3:1) 

4) 涡旋振荡5秒钟 

5) 将管子静置于超净工作台10~15分钟,使 PEI-DNA 复合物形成(建议共孵育时间不超过20分钟) 

6) 用移液器轻轻上下吹打混合液3次 


注:边晃动摇瓶,边将PEI-DNA 混合液加入更换了培养基的转染孔中,确保 PEI-DNA 复合物均匀分布,防止局部浓度过高。


3. 孵育培养 

将细胞培养瓶放入培养箱,摇瓶培养2~3小时后,加入25 mL新鲜培养基,继续培养。 

通常,在转染后36-48小时可检测到重组蛋白表达或包装的病毒颗粒。转染后72-96小时可观察到更大产量。


五、客户体验